Puromycin (10 mg/mL)

Catalog Number：PS610

01/產(chǎn)品概述

Puromycin是來(lái)源于Streptomyces alboniger的一種氨基核苷類抗生素，中文名為嘌呤霉素。嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3′末端的類似物，能夠與核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素同A位點(diǎn)結(jié)合后，不會(huì)參與隨后的任何反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽，從而殺死革蘭氏陽(yáng)性菌、各種動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞。

Puromycin常用于篩選通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒感染、轉(zhuǎn)化等方法能表達(dá)pac基因（puror）的真核或原核多克隆或單克隆細(xì)胞。pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶 (PAC，Puromycin N-acetyl-tranferase)，賦予機(jī)體對(duì)嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性目前普遍應(yīng)用于篩選表達(dá)pac基因的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定細(xì)胞株。嘌呤霉素在細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選中的普遍應(yīng)用與慢病毒載體的特性有關(guān)，現(xiàn)在很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質(zhì)粒圖譜上標(biāo)記為puror)，從而利用嘌呤霉素篩選特定基因的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。Puromycin的特點(diǎn)是快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99% 的不表達(dá)pac基因的細(xì)胞。Puromycin不僅用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，也用于穩(wěn)定細(xì)胞株的維持。在某些特定情況下，嘌呤霉素也可以用來(lái)篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。

本品是無(wú)菌的嘌呤霉素鹽酸鹽溶液（10 mg/mL），經(jīng)過(guò)濾除菌，可以直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。-20℃ 保存，有效期12個(gè)月。建議分裝保存，避免反復(fù)凍融。

04/產(chǎn)品特點(diǎn)

v 即用型試劑，無(wú)需進(jìn)行試劑配置，簡(jiǎn)單方便。

v 無(wú)菌制劑，可直接加入細(xì)胞使用。

05/實(shí)驗(yàn)步驟

一、Dose-response curve or kill curve嘌呤霉素劑量反應(yīng)曲線的確定(以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒感染為例）

嘌呤霉素的有效篩選濃度跟細(xì)胞類型、生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝及細(xì)胞所處細(xì)胞周期等因素相關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA或感染病毒的細(xì)胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/感染細(xì)胞的最小濃度嘌呤霉素非常重要。 對(duì)于初次使用的細(xì)胞，一般需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定適合自身實(shí)驗(yàn)體系的劑量反應(yīng)曲線(dose-response curve or kill curve)。

1. 提前一天在24孔板中以5~8×104cells/孔的密度接種細(xì)胞，設(shè)置劑量梯度及復(fù)孔，37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。

2. 次日，將培養(yǎng)過(guò)夜后的細(xì)胞更換含不同濃度嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基（新鮮配置），

如0、1、2.5、5、7.5、10、15、20 μg/mL等濃度梯度，設(shè)置至少5個(gè)濃度梯度，37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

3. 由于嘌呤霉素可以快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99% 的未表達(dá)pac基因的細(xì)胞，所以在添加嘌呤霉素后的1-2天就可以觀察細(xì)胞存活率，從而確定有效殺死正常細(xì)胞的藥物最小濃度。如果細(xì)胞耐藥性比較強(qiáng)，需要每日監(jiān)測(cè)細(xì)胞，觀察存活細(xì)胞率，約 2-3 天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，一般4-10天內(nèi)即可確定嘌呤霉素的最小濃度。

二、建議使用濃度

哺乳動(dòng)物細(xì)胞：1-10 μg/mL，最佳濃度需根據(jù)嘌呤霉素劑量反應(yīng)曲線來(lái)確定。

大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125 μg/mL。

? 使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié)，并受宿主細(xì)胞本身的影響。

三、哺乳動(dòng)物穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選

轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)?；蛘吒腥竞性摶虻牟《竞?，即可使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)株。

1. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染或感染48小時(shí)后，將細(xì)胞置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此為處理組。

? 當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時(shí)，抗生素作用明顯。細(xì)胞過(guò)于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會(huì)明顯下降，所以細(xì)胞的密度最好不超過(guò)35%。轉(zhuǎn)染或感染48小時(shí)后，如果細(xì)胞過(guò)密也可以消化后重新接種細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜后即可進(jìn)行嘌呤霉素篩選。

? 建議同時(shí)做一個(gè)空白正常細(xì)胞的對(duì)照組。

2. 每隔2-3天，更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。

3. 篩選2-10天后，對(duì)照組正常細(xì)胞應(yīng)該100% 死亡，處理組中存活的細(xì)胞為表達(dá)pac基因的細(xì)胞。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行多克隆或單克隆細(xì)胞的篩選。

? 應(yīng)每日進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要24小時(shí)，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在2-10天。

4. 待細(xì)胞可以穩(wěn)定生長(zhǎng)后，嘌呤霉素的濃度可以減半用于后續(xù)的培養(yǎng)。在得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后，一般建議嘌呤霉素也須持續(xù)加入，并2-3天更換含有嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)液。

06/適用范圍

Puromycin普遍應(yīng)用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選和維持，也可以用來(lái)篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。

07/注意事項(xiàng)

1. 為了您的健康安全，請(qǐng)規(guī)范操作，穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

2. 本產(chǎn)品對(duì)人體有害，操作時(shí)請(qǐng)小心，并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

3. 本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及治療。

08/實(shí)驗(yàn)案例分析

1. 提前一天使用10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001），待細(xì)胞密度為75% 左右開(kāi)始包裝慢病毒。

2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進(jìn)行慢病毒包裝，具體步驟參考LP110-10產(chǎn)品說(shuō)明書。

3. 收集慢病毒上清液，300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，0.22 μm濾器過(guò)濾，使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進(jìn)行20倍濃縮，使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution（LS110R）重懸慢病毒顆粒。

4. 提前一天在24孔板中鋪Hela細(xì)胞，使用上述制備的慢病毒感染目的細(xì)胞HeLa。在EP管中做病毒10倍梯度稀釋，連續(xù)6個(gè)稀釋梯度。稀釋方法如下：準(zhǔn)備6個(gè)?菌EP管，每個(gè)EP管中加?450μL 新鮮的*培養(yǎng)基（含10 μg/mL polybrene），取待測(cè)定病毒液50 μL加?到第?個(gè)EP管中（標(biāo)記50 μL），混勻后取50 μL病毒稀釋液加?到第?個(gè)EP管中（標(biāo)記5 μL），以此類推，直到稀釋到最后?管。棄去24孔板中原有的培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，并做好標(biāo)記，??操作，不要吹起細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

5. 慢病毒感染16 h后，吸去帶病毒的培養(yǎng)基，在每個(gè)孔中再加入?500 μL?預(yù)熱的新鮮*培養(yǎng)基。

6. 使用含puromycin（5 μg/mL）的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，對(duì)篩選7天后的細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫染色，并拍照記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

09/其他相關(guān)產(chǎn)品