PolyShooter^TM

NEO-PEI Transfection Reagent

DNA transfection reagent for large scale recombinant protein expression and virus production

Catalog Number：P09310

01/產(chǎn)品概述

PEI是基因轉(zhuǎn)染中常用的高分子載體，同時也是基因轉(zhuǎn)染的“金標(biāo)準(zhǔn)"。PEI轉(zhuǎn)染的原理是帶正電的陽離子聚合物與核酸中帶負(fù)電的磷酸基團形成帶正電的復(fù)合物后，再與細胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，通過細胞胞吞進入細胞。PEI主鏈上每三個原子就含有一個氮原子，因此具有較高的陽離子密度，這對于結(jié)合帶負(fù)電荷的核酸分子是非常有利的。在生理pH條件下，PEI部分胺基被質(zhì)子化，隨著體系pH值的降低，PEI剩余的胺基被質(zhì)子化，從而賦予了其出色的核酸結(jié)合能力和質(zhì)子緩沖能力，有利于通過質(zhì)子海綿效應(yīng)從內(nèi)涵體逃逸。但是，PEI高的陽離子電荷密度，導(dǎo)致其嚴(yán)重的細胞毒性。同時，PEI 25K含有4%-11％的殘留丙酰基，這可能阻礙聚合物主鏈與DNA的有效結(jié)合，影響基因轉(zhuǎn)染效率。因此，針對PEI的研究工作主要聚焦在通過功能化修飾以及脫丙酰基，來提高轉(zhuǎn)染效率、降低細胞毒性。

LeapWal PolyShooter NEO-PEI DNA 轉(zhuǎn)染試劑是一種基于分子量25 kDa PEI的DNA轉(zhuǎn)染試劑。通過對PEI進行功能改性，NEO-PEI 丙酰基*脫落，顯著改善了PEI的基因遞送性能，表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性和較低的細胞毒性。PolyShooter NEO-PEI與PEI 25000轉(zhuǎn)染試劑相比，具有很多優(yōu)點。包括：

1. PolyShooter NEO-PEI為即用型轉(zhuǎn)染試劑，無需配置，可直接用于細胞轉(zhuǎn)染實驗，而PEI 25000需要先把水調(diào)成弱酸性助其溶解，溶解后再用NaOH把pH調(diào)至中性，配置過程繁瑣復(fù)雜，容易引入誤差導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定。PEI 40000雖然較PEI 25000更易溶解，但也同樣存在配置繁瑣，配置過程中容易引入誤差的風(fēng)險。

2. PEI 25000含有4%-11%的丙?；鶜埩?，丙?；鶗柚咕酆衔镏麈溑cDNA結(jié)合，影響轉(zhuǎn)染效果。相較于PEI 25000，PolyShooter NEO-PEI丙?；?脫落，因此其性能始終高效如一。

LeapWal PolyShooter NEO-PEI DNA 轉(zhuǎn)染試劑是一種功能強大、值得信賴且經(jīng)濟實惠的瞬時轉(zhuǎn)染試劑，廣泛適用于多種細胞系，包括HEK-293、HEK-293T、CHO-K1、COS-1、COS-7、NIH/3T3、Sf9、HepG2和HeLa細胞等。同時，PolyShooter NEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑在大規(guī)模重組蛋白表達和病毒生產(chǎn)等領(lǐng)域有著高效、低毒、穩(wěn)定、可靠等顯著優(yōu)勢。PolyShooter NEO-PEI提供從96孔板到200L生物反應(yīng)器持續(xù)的高表達轉(zhuǎn)染體系，實現(xiàn)從新藥研發(fā)到工業(yè)化生產(chǎn)的輕松過度。與大多數(shù)細胞轉(zhuǎn)染方案相比，使用PolyShooter NEO-PEI既能得到穩(wěn)定的基因表達效率，又可顯著降低轉(zhuǎn)染成本。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wet ice）運輸。4℃保存，有效期6個月。-30℃至-10℃保存，有效期12個月，避免反復(fù)凍融。

04/產(chǎn)品特點

v 易于使用——即用型轉(zhuǎn)染試劑，無需配置，可直接用于細胞轉(zhuǎn)染實驗

v 轉(zhuǎn)染效率高——針對多種類型細胞，均表現(xiàn)出優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效率和高重組蛋白表達

v 細胞毒性低——作用溫和，能更好地實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率與低細胞毒性之間的平衡

v 性能更穩(wěn)定——丙?；?脫落，性能始終高效如一

v 高性價比——既能得到穩(wěn)定的基因表達效率，又可顯著降低轉(zhuǎn)染成本

v 化學(xué)成分明確，不含動物來源成分

05/適用范圍

PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent廣泛適用于多種細胞系的DNA轉(zhuǎn)染，可應(yīng)用于大規(guī)模重組蛋白表達和病毒生產(chǎn)等領(lǐng)域。本試劑提供從96孔板到200L生物反應(yīng)器持續(xù)的高表達轉(zhuǎn)染體系，實現(xiàn)從新藥研發(fā)到工業(yè)化生產(chǎn)的輕松過度。

06/實驗流程概要

圖1: PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent轉(zhuǎn)染實驗流程圖

07/實驗步驟（以24孔板為例，其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一：轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)）

1: 準(zhǔn)備待轉(zhuǎn)染細胞

貼壁細胞：轉(zhuǎn)染前一天，將消化后的細胞按照每孔0.3-2x10⁵個細胞的量進行鋪板，使其在轉(zhuǎn)染時密度為60%-70%。

懸浮細胞：轉(zhuǎn)染當(dāng)天，配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前，在24孔板中進行細胞鋪板，每500 µL生長培養(yǎng)基中加入2-5x10⁵個細胞。

? 細胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率，待轉(zhuǎn)染細胞應(yīng)處于良好生長狀態(tài)，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90% 的細胞進行轉(zhuǎn)染。

2: 準(zhǔn)備PolyShooter NEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物

（1）取1 μg質(zhì)粒加入到1.5 mL離心管中，加入2.5 μL* PolyShooter NEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?；旌希覝胤跤?分鐘。

? * PolyShooter NEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑使用量受細胞類型及其他實驗條件影響，通常情況下，DNA（μg）和PolyShooter NEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑（μL）的推薦使用比例為1：2.5。建議初次使用時，可在1：1-1：5的范圍內(nèi)調(diào)整以優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果。

（2）往上述混合物中加入100 μL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基¹（與培養(yǎng)體系一致，且無血清無雙抗），輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

? PolyShooter NEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物在室溫下4個小時內(nèi)保持穩(wěn)定。

（3）30分鐘后，往轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物中加入150 μL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基²（與培養(yǎng)體系一致，且無血清無雙抗）稀釋復(fù)合物。

3: 細胞轉(zhuǎn)染

棄去細胞培養(yǎng)基，將上述250 µL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細胞，轉(zhuǎn)染4-16小時后，給細胞補充新鮮生長培養(yǎng)基500 µL/孔。

4: 分析轉(zhuǎn)染細胞

轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)36-48小時后，可根據(jù)實際情況用熒光檢測法、Western Blot、RT-PCR、ELISA、流式細胞術(shù)、報告基因等檢測轉(zhuǎn)染效果，或加入篩選藥物進行穩(wěn)定細胞株的篩選。

表一：轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)

08/注意事項

1: 核酸質(zhì)量：想要獲得最高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細胞毒性，應(yīng)選用高純度、無菌、無污染、無內(nèi)毒素的優(yōu)質(zhì)核酸。質(zhì)粒中的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵，內(nèi)毒素會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率顯著下降。推薦使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進行質(zhì)粒提取，保證質(zhì)粒A₂₆₀/A₂₈₀比值為1.8-2.0。同時，需合理計算質(zhì)粒用量，轉(zhuǎn)染過量的質(zhì)?？赡軙?dǎo)致細胞毒性甚至死亡；

2: 細胞質(zhì)量：細胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90%的細胞進行轉(zhuǎn)染；

3: 細胞密度：建議細胞傳代后12-24 h內(nèi)、細胞密度為60%-70% 時進行轉(zhuǎn)染。不同的細胞轉(zhuǎn)染實驗，對細胞密度的要求不盡相同。在進行不同核酸或不同細胞系的轉(zhuǎn)染時，需要根據(jù)說明書再次優(yōu)化實驗條件。此外，在實驗過程中保證相同的接種條件，確保實驗數(shù)據(jù)的可重復(fù)性；

4: 質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑使用比例：對于大多數(shù)細胞系，轉(zhuǎn)染復(fù)合物中DNA (μg)與PolyShoote NEO-PEI Transfection Reagent (μL) 的比例在1：1至1：5之間，推薦比例為1:2.5。想要獲得*的轉(zhuǎn)染結(jié)果，需要對這一比例進行優(yōu)化，根據(jù)所轉(zhuǎn)染細胞及質(zhì)粒選擇適合的轉(zhuǎn)染比例；

5: PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent也可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染，但通過我們實驗室的測試，我們認(rèn)為體系中血清的存在會對轉(zhuǎn)染效果有一定程度的干擾，所以，為了追求更高效的轉(zhuǎn)染效率，我們更推薦使用無血清轉(zhuǎn)染法（即“07/實驗步驟"中敘述的轉(zhuǎn)染方法）；

6: 由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會抑制陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，因此有必要檢測特殊培養(yǎng)基與PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent的相容性；

7: 為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗；

8: 本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。

09/實驗案例分析

1: 轉(zhuǎn)染前一天，將圖2所示3種狀態(tài)良好的細胞接種于24孔板，使其在轉(zhuǎn)染時密度為60%-70%。

2: 按照每孔計量，取1μg GFP質(zhì)粒加入到1.5 mL離心管中，PolyShooter NEO-PEI組（圖2上）加入2.5 μL PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent與質(zhì)粒混合，PEI組（圖2下）加入2.5 μL PEI 25k與質(zhì)?；旌稀Ｊ覝胤跤?分鐘后，往混合物中加入100 μL無血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

3: 孵育30分鐘后，往轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物中加入150 μL無血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基稀釋復(fù)合物。

4: 將細胞培養(yǎng)基棄去，加入上述250 µL 轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

5: 轉(zhuǎn)染12小時后，給細胞補充新鮮生長培養(yǎng)基500 µL/孔。

6: 轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48小時后，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達情況，并拍照記錄，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2: 轉(zhuǎn)染細胞48小時后，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達情況

10/其他相關(guān)產(chǎn)品