PolyShooter TransfectionReagent

　　Polymer Reagent For Transfecting Common Cell Lines

Catalog Number：P09110

01/LeapWal PolyShooter 轉染試劑 P09110產品概述

　　細胞轉染是指將外源分子導入真核細胞內以改變其基因型或表型的一種技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發(fā)展，轉染已經成為研究和控制基因功能的常規(guī)手段，廣泛應用于基因功能研究、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等領域。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。其中化學介導方法因其兼具高效低毒、方便快捷等優(yōu)點，應用廣泛?；瘜W介導方法包括經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法以及多種陽離子物質介導的轉染方法。

　　理想的細胞轉染方法應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。已有眾多文獻報道，脂質體本身會參與細胞生理活動，影響基因表達，對研究數據產生一定程度的干擾。同時，脂質體會對目的細胞造成細胞毒性，這種毒性是由其脂質特性決定的。市面上多種商業(yè)化的脂質體轉染試劑要求細胞鋪板密度較高，以90%-95%為佳，這有助于減少陽離子脂質體細胞毒性造成的影響。但是，如果研究的基因要求比較長的表達時間，例如細胞周期相關基因，或者細胞表面蛋白，又或者轉染后續(xù)需要進行繼續(xù)培養(yǎng)和功能研究，則不適合用脂質體核酸轉染試劑。目前眾多的研究者和生物公司將新一代轉染試劑的開發(fā)聚焦在非脂質體的聚合物上，以尋找更高效低毒，同時對研究影響較小的轉染試劑。

　　LeapWal PolyShooter轉染試劑，即PolyShooter Transfection Reagent是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉染試劑，適用于DNA、RNA的轉染。其原理為帶正電的高分子聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的復合物后，與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內吞作用進入細胞，隨后在胞質中釋放，實現外源核酸的細胞轉染。

　　LeapWal PolyShooter 轉染試劑 P09110對多種常見細胞具有高水平轉染效率，具有高效低毒、操作簡單、重復性好等優(yōu)點。其*的配方使其可直接加入培養(yǎng)基中，血清的存在不會影響轉染效率，這樣可以減少去除血清對細胞的損傷。同時，轉染后不需要除去PolyShooterTransfectionReagent-核酸復合物或更換新鮮培養(yǎng)基，也可根據具體情況優(yōu)化轉染體系。

02/產品組分

03/保存條件

冰袋（wetice）運輸。4℃保存，有效期6個月。-30℃至-10℃保存，有效期12個月，避免反復凍融。

04/產品特點

　　優(yōu)秀的轉染效率——針對廣泛類型的細胞，均表現出優(yōu)秀的轉染效率和高重組蛋白表達水平

　　細胞毒性低——作用溫和，能較好地實現高轉染效率與低細胞毒性之間的平衡

　　操作簡單——在血清存在時亦具有可靠的轉染效率，轉染后無需去除復合物或更換新鮮培養(yǎng)基

　　高性價比——經濟的價格，同時實現高效的轉染效果

05/適用范圍

PolyShooter Transfection Reagent 采用陽離子高分子聚合物為主要成分，適用于DNA、RNA的轉染。

06/實驗流程概要

07/實驗步驟（以24孔板為例，其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一：轉染量度標準）

1:準備待轉染細胞

　　貼壁細胞：轉染前一天，將消化后的細胞按照每孔0.3-2x10^5個細胞的量進行鋪板，使其在轉染時密度為50%-60%。

　　懸浮細胞：轉染當天，配制轉染試劑-核酸復合物之前，在24孔板中進行細胞鋪板，每500µL生長培養(yǎng)基中加入2-5x10^5個細胞。

　　?細胞狀態(tài)會極大影響轉染效率，待轉染細胞應處于良好生長狀態(tài)，建議使用生長處于指數期、存活率大于90%的細胞進行轉染。

2:準備PolyShooter轉染試劑-核酸復合物

　　（1）取1μg質粒加入到1.5mL離心管中，加入2.5μL*PolyShooter轉染試劑與質?；旌希覝胤跤?分鐘。

　　?*轉染試劑使用量受細胞類型及其他實驗條件影響，通常情況下，DNA（μg）和PolyShooter轉染試劑（μL）的用量比例為1：2.5。建議初次使用時，可在1：2-1：5的范圍內調整以優(yōu)化轉染效果。

　　（2）往上述混合物中加入100μL無血清基礎培養(yǎng)基（與培養(yǎng)體系一致，且無血清無雙抗），輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成PolyShooter轉染試劑-核酸復合物。

　　?PolyShooter轉染試劑-核酸復合物在室溫下4個小時內保持穩(wěn)定。

3:細胞轉染

　　給細胞更換新鮮的預熱的*培養(yǎng)基500μL/孔，將上述100µLPolyShooter轉染試劑-核酸復合物加入每孔細胞，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。

　　?對于懸浮細胞系：轉染5小時后，可選擇加入PMA和/或PHA以提高CVM啟動子的活性并促進基因表達。對于Jurkat細胞，PHA和PMA的終濃度分別為1µg/mL和50ng/mL，可以提高CMV啟動子活性和基因表達。對于K562細胞，只加入PMA足以提高啟動子活性。

4.分析轉染細胞

　　轉染細胞培養(yǎng)24-48小時后，可根據實際情況用熒光檢測法、WesternBlot、RT-PCR、ELISA、流式細胞術、報告基因等檢測轉染效果，或加入篩選藥物進行穩(wěn)定細胞株的篩選。

08/注意事項

　　1.核酸質量：想要獲得最高的轉染效率和更低的細胞毒性，應選用高純度、無菌、無污染、無內毒素的優(yōu)質核酸。質粒中的內毒素是轉染的大敵，內毒素會導致轉染效率顯著下降，特別是對內毒素敏感的細胞，例如原代細胞、懸浮細胞、造血細胞等。推薦使用無內毒素質粒抽提試劑盒進行質粒提取，保證質粒A260/A280比值為1.8-2.0。同時，需合理計算質粒用量，轉染過量的質?？赡軙е录毎拘陨踔了劳觯?/p>

　　2.細胞質量：細胞狀態(tài)會極大影響轉染效率，建議使用生長處于指數期、存活率大于90%的細胞進行轉染；

　　3.細胞密度：建議細胞傳代后12-24h內、細胞密度為50%-60%時進行轉染。不同的細胞轉染實驗，對細胞密度的要求不盡相同。在進行不同核酸或不同細胞系的轉染時，需要根據說明書再次優(yōu)化實驗條件。此外，在實驗過程中保證相同的接種條件，確保實驗數據的可重復性；

　　4.質粒與轉染試劑使用比例：對于大多數細胞系，轉染復合物中DNA(μg)與PolyShooter Transfection Reagent(μL)的比例在1：2至1：5之間，推薦比例為1:2.5。想要獲得轉染結果，需要對這一比例進行優(yōu)化，根據所轉染細胞及質粒選擇適合的轉染比例；

　　5.PolyShooter Transfection Reagent可用于有血清培養(yǎng)基的轉染，并且轉染前后不需要換培養(yǎng)基。但是，制備轉染復合物時要求用無血清基礎培養(yǎng)基稀釋DNA和轉染試劑，因為血清會影響復合物的形成；

　　6.由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會抑制陽離子聚合物介導的轉染，因此有必要檢測特殊培養(yǎng)基與PolyShooter Transfection Reagent的相容性；

　　7.為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗；

　　8.本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。

09/實驗案例分析

　　1:轉染前一天，將圖2所示9種狀態(tài)良好的細胞接種于24孔板，使其在轉染時密度約為50%。

　　2:按照每孔計量，取1μgGFP質粒加入到1.5mL離心管中，加入2.5μL PolyShooter Transfection Reagent與質?；旌?，室溫孵育3min后，往混合物中加入100μL無血清基礎DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30min，形成PolyShooter轉染試劑-核酸復合物。

　　3:給細胞更換新鮮的預熱的*培養(yǎng)基500μL/孔，將上述100µLPolyShooter轉染試劑-核酸復合物加入每孔細胞，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。

　　4：轉染細胞培養(yǎng)48小時后，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達情況，并拍照記錄，實驗結果如圖2所示。

圖2:轉染細胞培養(yǎng)48小時后，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達情況

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